Quý Cô Ngày Và Đêm kể về Lee Mi Jin, một người phụ nữ tìm kiếm công việc, đã phải chịu nhiều khó khăn vì phải đảm nhận nhiều công việc bán thời gian khác nhau và chuẩn bị cho công việc chính trong thời gian dài. Một ngày định mệnh, vì một sự cố bất ngờ, cô bỗng trở thành Yim Soon (Lee Jung Eun) 50 tuổi ban ngày và trẻ trở lại là Lee Mi Jin (Jung Eun Ji) tuổi 20 vào ban đêm. Sự thay đổi phi thường này không làm chùn bước Mi Jin. Thay vào đó, cô nhìn nhận nó như một cơ hội mới để mở ra cánh cửa thành công trong tìm kiếm việc làm. Với sự tích lũy kinh nghiệm từ nhiều năm làm việc ở tuổi 20 và sự trưởng thành ở tuổi 50, Mi Jin đã khôn ngoan tận dụng kiến thức và kỹ năng của mình để vượt qua mọi thách thức. Sự hỗ trợ của ngoại hình trẻ hơn vào buổi tối và trí tuệ độ tuổi trung niên vào ban ngày đã giúp cô thành công trong việc đạt được công việc mà cô luôn khao khát.